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Vergleich SEC/AUZ

Die zur Zeit am häufigsten eingesetzte Methode zur Charakterisierung von Aggregaten ist die Größenauschlußchromatographie (SEC). Sie ist einfach zu bedienen, liefert schnell Ergebnisse und benötigt lediglich kleine Probenmengen für eine sensitive und reproduzierbare Analyse von Biopharmazeutika. Die benötigten Gerätschaften sind günstig erhältlich und der Analysenablauf kann weitestgehend automatisiert werden. Diese günstigen Eigenschaften haben dazu geführt, daß SEC die industrielle Standardmethode für die Analyse von Biopharmazeutika geworden ist. Andererseits ist es in der Regel notwendig, das Lösungsmittel für die Analyse zu verändern und es erfolgt eine signifikante Verdünnung der Probe zwischen dem Punkten der Probenaufgabe und –detektion. Beide Faktoren können die Menge und Verteilung von ursprünglich in der Probe vorhandenen Aggregaten deutlich verändern. Dies trifft besonders für schwach assoziiertes Material zu. Eine ausgedehnte Grenzfläche existiert zwischen der SEC-Säulenmatrix und der mobilen Phase, die ein hohes Potential für nicht-spezifische Interaktionen aufweist. Weiterhin ist der Trennbereich einer SEC-Matrix nicht immer in der Lage, den gesamten Größenbereich einer Probe abzudecken und beschränkt damit die über die wahre Verteilung zugängliche Information. Alle diese Faktoren tragen zum erheblichen Risiko der SEC für falsch positive und falsch negative Signale bei.

Analytische Ultrazentrifugation (AUC) ist in vielerlei Hinsicht das Gegenteil von SEC. Sie ist eine komplexe Methode, die wenig Verbreitung gefunden hat. Aufgrund ihrer einzigartigen Vorteile hat sie jedoch in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. AUC benötigt ein “teures” Meßgerät sowie spezialisiertes und hoch qualifiziertes Personal, um das Instrument zu bedienen und Daten guter Qualität zu erhalten. AUC ist eine vergleichsweise langsame Methode und bedarf einer umfangreichen Datenauswertung durch erfahrene Mitarbeiter. Aus diesen Gründen kann sie nicht automatisiert werden und ermöglicht lediglich einen geringen Probendurchsatz. Auf der anderen Seite ist für eine Analyse mit AUC kein Wechsel des Lösungsmitttels notwendig und die Probe wird im Verlauf des Analyse nur minimal (um ca. 20%) verdünnt. Daher verändert AUC auch nicht die initiale Aggregatsverteilung. Es existiert keinerlei feste Matrix, die Auftrennung in einzelne Komponenten erfolgt lediglich aufgrund der angewandten Zentrifugationskraft und im nativen Lösungsmittel. Die Grenzfläche zwischen Küvette und Lösung ist minimal und besteht aus chemisch und physikalisch inertem Material, so daß es zu keiner Veränderung der Probe kommt. Der mit einem einzelnen AUC-Experiment zugängliche Größenbereich erstreckt sich ohne Probleme über vier Größenordnungen der Molmasse. Dadurch kann sichergestellt werden, daß die ursprüngliche Größenverteilung der Probe in der Analyse präzise und richtig widergegeben wird. Zusammengefasst machen diese Eigenschaften AUC zu einer ideal geeigneten, orthogonalen Methode um ein SEC-Ergebnis zu bestätigen und zu validieren. Darüber hinaus erschließt die AUC eine Vielzahl weiterer Molekülparameter, die mittels SEC nicht zugänglich sind.

Die folgende Tabelle gibt einen Überblick für beide Methoden, wobei die Anzahl der Pluszeichen das Ausmaß des jeweiligen Effekts anzeigt:

In einer Vergleichsstudie haben Gabrielson et al. vor kurzem die Fähigkeit von SEC, assymmetrischer Feldflußfraktionierung (AF4) und AUC untersucht, Aggregate in säuregestressten und ungestressten Präparationen von humanisierten monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu detektieren. Die Autoren finden, daß SEC im Vergleich zu AUC und AF4 den Aggregatgehalt der gestressten Probe signifikant unterschätzt. Darüber hinaus konnte SEC große Aggregate, die mit AUC und AF4 beschrieben wurden, nicht detektieren. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen, den AUC als orthogonale Methode in der Entwicklung und Validierung von SEC-Protokollen hat.

Referenz:

Gabrielson JP, Brader ML, Pekar AH, Mathis KB, Winter G, Carpenter JF & Randolph TW (2007) Quantitation of Aggregate Levels in a Recombinant Humanized Monoclonal Antibody Formulation by Size-Exclusion Chromatography, Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation, and Sedimentation Velocity. J Pharm Sci 96(2):268-279.