Nanolytics
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AUZ in der Biochemie


Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) ist eine klassische Methode der Biochemie – das 80S-Ribosome ist ein klassisches Beispiel, wobei „S“ für Svedberg steht, der Einheit, in der der Sedimentationskoeffizient üblicherweise angegeben wird. Sie ist die Referenzmethode zur Beschreibung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und kann wertvolle Informationen über Proteine, Nukleinsäuren, Viren, Lipide, Kohlenhydrate und ihre jeweiligen Komplexe liefern.

Die wichtigsten Vorteile der AUZ für die Charakterisierung Ihrer Proteine:

  • Keine Standards benötigt
  • AUZ ist sensitiv, genau, richtig und robust
  • Keine Interaktionen mit einer stationären Phase oder Matrix
  • Ein grosser Bereich molarer Massen kann im gleichen Experiment untersucht werden – AUZ funktioniert mit Peptiden und Viren
  • Keine Modifizierung des Proteins notwendig
  • Kein Wechsel der mobilen Phase – Ihr Protein wird in genau dem Lösungsmittel untersucht, in dem Sie es untersuchen wollen
  • Die Theorie der Sedimentation ist gut verstanden und geht von elementaren physikalischen Grundprinzipien aus
  • Alle zusätzlich benötigten Parameter können unabhängig bestimmt werden
  • AUZ ist eine orthogonale Methode zu SEC und/oder FFF und kann helfen, Protokolle für diese beiden Methoden zu validieren

Beispiele für tatsächliche Anwendungen:

  • Aggregatgehalt eines Proteins
  • Selbstassoziation eines Proteins

Aggregatgehalt eines Proteins:

Dies ist ein Beispiel für BSA in einer Konzentration von 1 mg/mL in PBS-Puffer, untersucht mittels Sedimentationsgeschwindigkeit (SV).
Aggregatgehalt 1

Dominierende Signale stammen von monomerem (72%) und dimerem (19%) BSA, die beide gut aufgelöst sind. Die hervorragende Auflösung, die mit AUZ erreicht werden kann, wird noch deutlicher, wenn man sich auf die kleinen Anteile der Probe fokussiert.
Aggregatgehalt 2

Etwa 3% der Probe stammen von einem wahrscheinlich proteolytischen Fragment, 4% sind tetrameres BSA und 2% höhere Polymere, wahrscheinlich Hexa- und Octamere. Diese Art von Analyse ist hervorragend für Stabilitätsstudien (gestresste/nicht-gestresste Probe) geeignet, für die Validierung einer SEC und/oder FFF-Analyse oder um den Einfluss von Reinigungsprotokollen auf den Aggregatgehalt der Proteinpräparation festzustellen. Sie ist ebenfalls geeignet, die Gleichwertigkeit von Proteinen aus verschiedenen Zellinien zu beweisen.

Selbstassoziation eines Proteins:

Das Folgende zeigt den Fall eines selbstassoziierenden Proteins. Selbsassoziation ist eine intrinsische Eigenschaft des jeweiligen Moleküls und ist oft für eine korrekte Funktion notwendig.
Selbstassoziation 1

Ein neues Signal erscheint bei kleineren Sedimentationskoeffizienten für die geringer konzentrierte Probe. Der mittlere Sedimentationskoeffizient wird ebenfalls kleiner.
Selbstassoziation 2

Eine quantitative und qualitative Beschreibung der Selbstassoziation wird über Sedimentationsgleichgewichtsexperimente (SE) erreicht.
Selbstassoziation 3

Die experimentellen Daten (offene Punkte, lediglich jeder 3. Datenpunkt gezeigt) werden über ein theoretisches Modell (durchgezogene Linien) für ein Monomer-Dimer mit einer Dissoziationskonstante von 1µM beschrieben. Die Tatsache, daß der theoretische Verlauf dem der experimentellen Daten gut entspricht, ist ein Zeichen, daß die Beschreibung der Daten richtig ist. Dieses Experiment ist geeignet, um die biologische Ähnlichkeit von Proteinen zu beweisen oder um Bindungsoberflächen zu charakterisieren.