Analytische Ultrazentrifugation - Sedimentationsgleichgewicht

Das Sedimentationsgleichgewichtsexperiment dient der Bestimmung von Molekulargewichten. Dies ist ein Klassiker der AUZ-Anwendung; lange Jahrzehnte wurden Molmassen von Proteinen auf diese Weise bestimmt. Heutzutage konkurriert die Analytische Ultrazentrifugation mit anderen, billigeren Methoden, insbesondere der GPC, und die Bestimmung von Molmassen kann in der Tat oft schneller und billiger mit alternativen Methoden durchgeführt werden.

Für Sie kann die Molmassenbestimmung mittels Analytische Ultrazentrifugation dennoch aus verschiedenen Gründen in Frage kommen:

  • Bei chromatographischen Methoden haben Sie Probleme mit Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial.
  • Es steht kein geeigneter Standard zur Verfügung, oder die Kalibrierung ist zu aufwendig, so daß Sie eine Absolutmethode bevorzugen.
  • Sie verwenden ein Lösemittel, für das keine geeignete Säule zur Verfügung steht.
  • Die Molmassen sind entweder sehr klein oder sehr groß.
  • Die Partikel verfügen über Geometrien, die bei alternativen Methoden zu Problemen führen.
  • Sie interessieren sich außerdem für interpartikuläre Wechselwirkungen.
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In der Genauigkeit ist die Analytische Ultrazentrifugation bei einem Fehler von 3% bis heute unübertroffen. Es ist erforderlich, die Dichte der Partikel zu kennen, ansonsten muß die aufwendigere Methode der Dichtevariation angewandt werden. Die benötigten Probenmengen sind sehr klein.

Gleichgewichtsprofil innerhalb der Messzelle
Abbildung 1: Gleichgewichtsprofil innerhalb der Messzelle.
Das Meßprinzip besteht in der Ausbildung eines dynamischen Gleichgewichts innerhalb der Meßzelle. Zunächst bewirkt das Schwerefeld eine Sedimentation der Partikel zum Zellboden hin; damit erhöht sich dort deren Konzentration. Dies hat zur Folge, daß die Diffusion vom Boden entgegen dem Sedimentationsfeld immer stärker zunimmt, denn die Diffusion ist konzentrationsabhängig. Nach hinreichender Laufzeit (bis zu mehreren Tagen) bildet sich ein stationärer Zustand aus. Im Gleichgewicht liegt innerhalb der Meßzelle ein exponentielles Konzentrationsprofil vor, wie in nebenstehender Abbildung dargestellt. Dieses Profil gibt unter Verwendung der experimentellen Parameter Aufschluß über die Molmasse.

Zwar kann die Molmasse auch aus dem schnelleren Sedimentationsgeschwindigkeitsexperiment berechnet werden, jedoch sind zur Auflösung der zugrundliegenden Gleichung zwei Transportgrößen, nämlich die Sedimentationskonstante und der Diffusionskoeffizient, erforderlich. Damit summieren sich die experimentellen Fehler aus diesen beiden Größen. Das Gleichgewichtsexperiment eliminiert die Transportgrößen und ist somit im allgemeinen genauer.

Bei Verteilungen wird das Gewichtsmittel erhalten. Jedoch ist auch das Zahlen- und das z-Mittel zugänglich. Dies ist eine Frage der Auswertung, zu der es in der Literatur eine Vielzahl von Ansätzen gibt. Wir verwenden zur Auswertung die anspruchsvolle M*-Funktion nach Creeth und Harding, die modellunabhängig arbeitet und zudem eine hohe statistische Sicherheit bietet.

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